原核 Argonautes (pAgos) 已被提議作為更靈活的基因編輯工具,因為與流行的 CRISPR/Cas 系統不同,它們不需要與其功能目標相鄰的序列基序。來自嗜鹽古菌 Natronobacterium gregoryi的一種有前途的 pAgo (NgAgo)  候選物一直是關于其在真核系統中潛力的爭論的主題。

2021年9月3日,普渡大學Kevin V Solomon團隊在Nucleic Acids Research(IF=16.97) 在線發表題為“NgAgo possesses guided DNA nicking activity ”的研究論文,該研究發現NgAgo 在非嗜鹽宿主中表達不佳,即使在重折疊后,大多數蛋白質仍不溶且無活性。然而,可溶性部分確實起到了切割 DNA 核酸內切酶的作用。NgAgo 與其他具有催化活性的 pAgo 共享規范域,但也包含以前無法識別的單鏈 DNA 結合域 (repA)。repA 和規范的 PIWI 結構域都參與了 NgAgo 的 DNA 切割活動。NgAgo 可以在大腸桿菌中和體外在指導序列 3' 末端外 1 nt 處切割靶向 DNA。該研究還發現,這些核酸內切酶活性對于大腸桿菌中增強的 NgAgo 引導的同源重組或基因編輯至關重要。

總的來說,該研究發現NgAgo 是一種新型 DNA 核酸內切酶,屬于由特征 repA 結構域定義的未被識別的 pAgo 類。NgAgo 使用 PIWI 中保守的和新的未表征的 repA 結構域來切割 DNA。NgAgo的這種切割介導原核生物中的基因編輯作用。該研究工作建立了探索 NgAgo 活性(以及其他 pAgo 的活性)的創新方法,并確定了將其發展為下一代合成生物學工具的關鍵蛋白質特征。

基因編輯是一種通過靶向修飾改造基因組的新技術。自發現以來,CRISPR/Cas9系統已成為基因組編輯庫中最強大的工具之一。盡管 CRISPR/Cas9 系統受到研究人員的歡迎,但它也有其不完善之處。CRISPR/Cas9 系統對靶標識別的幾種脫靶活性和 PAM 要求限制了其在某些基因組序列中的應用。因此,尋找新的基因編輯方法仍然是一個好的選擇。除了 Cas9 蛋白家族外,有研究報道 Argonaute (Ago) 蛋白家族,包括 TtAgo和 PfAgo,也具有一定的基因編輯能力。

在原核生物和真核生物中都發現了 Argonautes。在真核生物中,Argonaute 蛋白是 RNA 誘導的沉默復合物 (RISC)的重要組成部分。真核生物 Ago 蛋白在 RNA 干擾 (RNAi)、microRNA 和 piwi 相互作用 RNA (piRNA) 介導的轉錄后沉默中起著至關重要的作用。一些原核 Ago 蛋白,如 TtAgo 和 PfAgo,可以誘導外源基因在小干擾核酸或引導 DNA (gDNA) 的指導下降解 。然而,TtAgo 和 PfAgo 通常在 65 °C 左右起作用,限制了它們在哺乳動物細胞中的應用。

2016年5月3日,韓春雨團隊在Nature Biotechnology 在線發表題為“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的研究論文,該研究發現Natronobacterium gregoryi Argonaute(NgAgo)是一種DNA引導的核酸內切酶,適用于人類細胞的基因組編輯,這一下子使NgAgo火遍全球,廣大研究人員去驗證其效果,很不幸,沒有相關的團隊能確定NgAgo有基因編輯的功能。隨后引發廣泛質疑,2017年8月3日,韓春雨撤回該論文。

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NgAgo 專門切割與向導互補的 DNA(圖源自Nucleic Acids Research )

不過,其他團隊有另外的發現,南通大學劉東團隊在Cell Research 發表題為“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的研究論文,該研究發現gDNA / NgAgo可以與靶基因結合以阻斷其轉錄,同時該研究也沒有發現NgAgo具有基因編輯的能力。

該研究重新表征NgAgo在原核生物中的功能。NgAgo 在非嗜鹽宿主中表達不佳,即使在重折疊后,大多數蛋白質仍不溶且無活性。然而,該研究發現可溶性部分確實起到了切割 DNA 核酸內切酶的作用。NgAgo 與其他具有催化活性的 pAgo 共享規范域,但也包含以前無法識別的單鏈 DNA 結合域 (repA)。repA 和規范的 PIWI 結構域都參與了 NgAgo 的 DNA 切割活動。

NgAgo 可以在大腸桿菌中和體外在指導序列 3' 末端外 1 nt 處切割靶向 DNA。該研究還發現,這些核酸內切酶活性對于大腸桿菌中增強的 NgAgo 引導的同源重組或基因編輯至關重要??偟膩碚f,該研究結果證明了 NgAgo 在基因編輯方面的潛力,并為看似矛盾的報告提供了新的見解。


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